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基于实时荧光定量PCR筛选巨菌草内参基因

李苏涛 李妍 张磊 陈思齐 韩雪林 张娟 苏德伟 罗海凌 周晶

引用本文: 李苏涛,李妍,张磊,陈思齐,韩雪林,张娟,苏德伟,罗海凌,周晶. 基于实时荧光定量PCR筛选巨菌草内参基因. 草业科学, 2022, 39(5): 1-15 doi: shu
Citation:  LI S T, LI Y, ZHANG L, CHEN S Q, HAN X L, ZHANG J, SU D W, LUO H L, ZHOU J. Screening of reference genes of based on real-time fluorescence quantitative PCR. Pratacultural Science, 2022, 39(5): 1-15 doi: shu

基于实时荧光定量PCR筛选巨菌草内参基因

    作者简介: 李苏涛(1997-),男,江苏南通人,在读硕士生,主要从事动物营养与饲料科学研究。E-mail: 1156034071@qq.com
    通讯作者: 周晶(1983-),女,甘肃兰州人,助理研究员,博士,主要从事草业科学与饲料科学理论研究及技术应用。E-mail: zhoujing_lz@hotmail.com
  • 基金项目:   国家自然科学基金项目(32101418,42075116);福建省重大专项(2021NZ0101)

摘要: 以巨菌草(Pennisetum giganteum)的叶片、茎、根为试验材料,通过分析8个基因18s rRNA、Actin、GAPDH、ACTB、EF-1α、UBQ、CYP、TUB在正常生长、干旱以及盐碱胁迫下荧光定量PCR中稳定性表达情况,筛选巨菌草的稳定内参基因。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件计算内参基因的表达稳定值并进行排序,最终通过赋值法综合排序确定稳定内参基因。结果表明,内参基因的稳定性在不同处理下存在差异。其中,ACTB稳定性好,为本研究筛选出巨菌草的内参基因。本研究筛选出的内参基因,为后续巨菌草功能基因表达分析奠定了基础。

English

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    图 1  内参基因的PCR扩增产物

    Figure 1.  PCR amplification products of 8 reference genes

    图 2  内参基因溶解曲线图

    Figure 2.  Melting curves of 8 reference genes

    图 3  正常生长下不同组织中内参基因geNorm分析稳定值

    Figure 3.  Expression stability value of the reference genes in different tissues under normal growth by geNorm

    图 4  正常生长下不同组织中配对差异分析(Vn/n+1)最佳组合的内参基因数

    Figure 4.  Paired difference analysis (Vn/n+1), the best combination of reference genes number in different tissues under normal growth

    图 5  不同干旱胁迫、不同组织中内参基因geNorm分析稳定值

    Figure 5.   Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different drought stress by geNorm

    图 6  不同干旱胁迫、不同组织中配对差异分析(Vn/n+1)最佳组合的内参基因数

    Figure 6.  Paired difference analysis (Vn/n+1), the best combination of reference genes number in different tissues under different drought stresstress

    图 7  不同盐碱胁迫、不同组织中内参基因geNorm分析稳定值

    Figure 7.  Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different salt-alkali stress by geNorm

    图 8  不同盐碱胁迫、不同组织中配对差异分析(Vn/n+1)最佳组合的内参基因数

    Figure 8.  Paired difference analysis (Vn/n+1), the best combination of reference genes number in different tissues under different salt-alkali stress

    表 1  内参基因信息及其引物序列

    Table 1.  Information of reference genes and their primer sequences

    基因
    Gene
    上游引物
    Forward primer (5′-3′)
    下游引物
    Reverse primer (5′-3′)
    片段大小
    Clip size/bp
    基因编号
    Gene ID
    18s rRNA CTACGTCCCTGCCCTTTGTACA ACACTTCACCGGACCATTCAA 65 AK059783
    GAPDH CCATCACTGCCACACAGAAAAC AGGAACACGGAAGGACATACCAG 170 X07156.1
    Actin TGCTCAGTGGAGGGTCTACCAT CAGGTGGTGCAATCACTTTAAT 108 PgACT
    ACTB CTGGAATGGTCAAGGCTGGT TCCTTCTGTCCCATCCCTACC 112 XM_008658343.4
    EF-1α TGGGCCTACTGGTCTTACTACTGA ACATACCCACGCTTCAGATCCT 135 NM_001112117.1
    UBQ CAGCAGCGGCTCATCTT GCTTCTTGGGCTTGGTGTA 154 AK061988
    TUB GCTGACCACACCTAGCTTTGG AGGGAACCTTAGGCAGCATGT 82 AK072502
    CYP TGTAGACCACGTCCATTCCA GCTGGGAAAGATACAAACGGA 115 XM_037608623.1
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    表 2  正常生长下不同组织中内参基因NormFinder分析稳定值

    Table 2.  Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under normal growth by NormFinder

    组织
    Tissue
    内参基因Reference gene
    18s rRNAGAPDHActinACTBEF-1αUBQCYPTUB
    叶 Leaf 0.052 0.213 0.017 0.017 0.030 0.185 0.322 0.056
    茎 Stem 0.126 0.111 0.095 0.006 0.419 0.039 0.036 0.126
    根 Root 0.021 0.053 0.034 0.010 0.114 0.087 0.429 0.121
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    表 3  正常生长下不同组织中内参基因BestKeeper分析标准差

    Table 3.  Standard deviation of reference genes in different tissues under normal growth by BestKeeper analysis

    组织
    Tissue
    内参基因 Reference gene
    18s rRNAGAPDHActinACTBEF-1αUBQCYPTUB
    叶 Leaf 0.10 0.21 0.04 0.07 0.04 0.15 0.34 0.05
    茎 Stem 0.09 0.09 0.08 0.04 0.42 0.05 0.05 0.16
    根 Root 0.04 0.10 0.04 0.08 0.14 0.09 0.40 0.14
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    表 4  不同干旱胁迫、不同组织中内参基因NormFinder分析稳定值

    Table 4.  Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different drought stress by NormFinder

    干旱胁迫时间
    Drought stress time/d
    组织
    Tissue
    内参基因 Reference genes
    18s rRNAGAPDHActinACTBEF-1αUBQCYPTUB
    7叶 Leaf0.0680.0970.1000.0060.0600.0510.2360.016
    茎 Stem0.0210.0150.0620.0200.0360.3470.0340.273
    根 Root0.0290.1330.0860.0290.1290.1430.1490.273
    14叶 Leaf0.0770.0150.0150.0200.0830.3240.2540.094
    茎 Stem0.0240.0390.0860.1130.0860.0310.2010.107
    根 Root0.0520.0890.0420.0440.0500.0160.0410.101
    21叶 Leaf0.1060.0090.0120.0320.0830.0390.2170.155
    茎 Stem0.0460.0670.0800.0090.1850.1180.1950.035
    根 Root0.0180.0180.0620.0750.1580.1910.1290.183
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    表 5  不同干旱胁迫、不同组织中内参基因BestKeeper分析稳定值

    Table 5.  Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different drought stress by BestKeeper

    干旱胁迫时间
    Drought stress time/d
    组织
    Tissue
    内参基因的标准差 The standard deviation of reference genes
    18s rRNAGAPDHActinACTBEF-1αUBQCYPTUB
    7叶 Leaf0.070.110.110.080.060.070.240.03
    茎 Stem0.070.050.100.020.090.310.090.24
    根 Root0.060.130.030.070.120.130.160.30
    14叶 Leaf0.090.040.050.040.090.330.240.10
    茎 Stem0.020.080.120.090.060.050.220.07
    根 Root0.030.110.080.010.100.060.020.11
    21叶 Leaf0.130.070.050.020.110.020.190.17
    茎 Stem0.070.060.080.060.160.100.210.06
    根 Root0.020.030.100.100.160.210.100.16
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    表 6  不同盐碱胁迫、不同组织中内参基因NormFinder分析稳定值

    Table 6.  Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different salt-alkali stress by NormFinder

    盐碱胁迫浓度
    Salt-alkali stress
    concentration/(mmol·L−1)
    组织
    Tissue
    内参基因 Reference genes
    18s rRNAGAPDHActinACTBEF-1αUBQCYPTUB
    60 叶 Leaf 0.157 0.115 0.136 0.101 0.027 0.062 0.146 0.090
    茎 Stem 0.089 0.063 0.041 0.069 0.076 0.090 0.146 0.034
    根 Root 0.074 0.029 0.154 0.121 0.189 0.130 0.039 0.086
    120 叶 Leaf 0.012 0.011 0.011 0.040 0.153 0.151 0.335 0.104
    茎 Stem 0.072 0.110 0.134 0.099 0.089 0.027 0.266 0.086
    根 Root 0.175 0.032 0.115 0.130 0.139 0.064 0.116 0.162
    180 叶 Leaf 0.039 0.013 0.134 0.156 0.107 0.097 0.097 0.098
    茎 Stem 0.092 0.051 0.174 0.023 0.083 0.14 0.235 0.013
    根 Root 0.077 0.150 0.113 0.054 0.020 0.017 0.196 0.137
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    表 7  不同盐碱胁迫、不同组织中内参基因BestKeeper分析标准差

    Table 7.  Standard deviation of reference genes in different tissues under different salt-alkali stress by BestKeeper analysis

    盐碱胁迫浓度
    Salt-alkali stress
    concentration/(mmol·L−1)
    组织
    Tissue
    内参基因 Reference genes
    18s rRNAGAPDHActinACTBEF-1αUBQCYPTUB
    60 叶 Leaf 0.16 0.10 0.13 0.13 0.03 0.09 0.15 0.07
    茎 Stem 0.08 0.04 0.05 0.09 0.04 0.12 0.18 0.04
    根 Root 0.03 0.11 0.22 0.08 0.25 0.16 0.16 0.10
    120 叶 Leaf 0.07 0.04 0.05 0.12 0.22 0.21 0.25 0.18
    茎 Stem 0.10 0.14 0.13 0.10 0.07 0.04 0.24 0.10
    根 Root 0.15 0.04 0.13 0.11 0.13 0.08 0.13 0.18
    180 叶 Leaf 0.08 0.04 0.18 0.17 0.12 0.09 0.07 0.06
    茎 Stem 0.09 0.09 0.18 0.07 0.12 0.17 0.17 0.06
    根 Root 0.15 0.13 0.15 0.09 0.11 0.07 0.25 0.04
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    表 8  不同处理、不同组织中内参基因稳定性综合排序

    Table 8.  Comprehensive ranking of the stability of reference genes in different tissues under different treatments

    处理组
    Treatment group
    内参基因
    Reference gene
    叶 Leaf茎 Stem根 Root
    稳定性分值
    Stability score
    排序
    Ranking
    稳定性分值
    Stability score
    排序
    Ranking
    稳定性分值
    Stability score
    排序
    Ranking
    正常生长
    Normal growth
    18s rRNA 14 16 8
    GAPDH 21 16 10
    Actin 3 11 11
    ACTB 6 3 5
    EF-1α 8 24 16
    UBQ 18 6 15
    CYP 24 8 24
    TUB 11 20 16
    干旱胁迫
    Drought stress
    18s rRNA 14 3 3
    GAPDH 5 7 11
    Actin 6 18 9
    ACTB 7 6 7
    EF-1α 14 17 19
    UBQ 14 16 18
    CYP 22 24 15
    TUB 21 11 24
    盐碱胁迫
    Salt-alkali stress
    18s rRNA 14 13 17
    GAPDH 3 8 8
    Actin 14 19 20
    ACTB 21 8 7
    EF-1α 13 9 17
    UBQ 7 18 4
    CYP 24 24 15
    TUB 8 3 14
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  • 通讯作者:  周晶, zhoujing_lz@hotmail.com
  • 收稿日期:  2021-11-12
  • 接受日期:  2022-03-08
  • 网络出版日期:  2022-04-21
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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