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快速鉴定紫花苜蓿混入苜蓿菟丝子的分子方法及其通用性

吴昱果 周强 贾程琳 刘志鹏

引用本文: 吴昱果,周强,贾程琳,刘志鹏. 快速鉴定紫花苜蓿混入苜蓿菟丝子的分子方法及其通用性. 草业科学, 2022, 39(7): 1-8 doi: shu
Citation:  WU Y G, ZHOU Q, JIA C L, LIU Z P. A universal molecular method for rapid identification of alfalfa and dodder seeds. Pratacultural Science, 2022, 39(7): 1-8 doi: shu

快速鉴定紫花苜蓿混入苜蓿菟丝子的分子方法及其通用性

    作者简介: 吴昱果(1994-),女,湖北襄阳人,在读博士生,研究方向为牧草种质资源与分子育种。E-mail: wuyg16@onlabwinterschool.com
    通讯作者: 刘志鹏(1979-),男,陕西武功人,教授,博士,研究方向为牧草种质资源与分子育种。E-mail: lzp@onlabwinterschool.com
  • 基金项目: 国家重点研发计划重点专项项目课题(2019YFC0507702)

摘要: 紫花苜蓿(Medicago sativa)种子和杂草菟丝子(Cuscuta spp.)种子在颜色、大小和形状上有很多相似之处。传统牧草种子纯度的评价方法是形态学比较,主要依赖感官辨认和经验,但是,种子形态间的相似性极大增加了形态鉴别的难度,耗时长且不准确。本研究基于紫花苜蓿和寄生植物苜蓿菟丝子(C. approximata)叶绿体rbcL (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large, rbcL)基因的序列差异,设计针对苜蓿菟丝子的特有引物,对紫花苜蓿和苜蓿菟丝子的DNA同时进行PCR扩增,最终通过观察是否扩增出苜蓿菟丝子的DNA片段,来检验紫花苜蓿的种子纯度。此外,在苜蓿菟丝子和紫花苜蓿种子DNA和种子粒数比例分别为1 ꞉ 10 000和1 ꞉ 1 000时,该方法也可以准确扩增出紫花苜蓿中混杂的菟丝子。因此,该方法具有可靠性高、检测速度快、灵敏度高等优点,为海关检疫紫花苜蓿种子中是否携带寄生植物苜蓿菟丝子种子提供便捷的检测技术,对种子生产和牧草育种具有重要意义。

English

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    图 1  紫花苜蓿和苜蓿菟丝子叶绿体DNA部分rbcL基因区域的序列比对

    Figure 1.  Sequence alignments of a portion of the rbcL regions of alfalfa and dodder chloroplast DNA

    水平黑色箭头表示用于PCR扩增的引物位置。垂直的黑色箭头表示在引物位置处由单核苷酸多态性 (single-nucleotide polymorphisms, SNPs)和小于50 bp的片段插入或缺失(insertions and deletions, InDels)引起的序列差异。

    The horizontal black arrows indicate the locations of the primers used for PCR amplification. The vertical black arrows indicate sequence differences resulting from SNPs (single-nucleotide polymorphisms) and InDels (insertions and deletions) at primer locations.

    图 2  紫花苜蓿和苜蓿菟丝子种子

    Figure 2.  Seeds of Medicago sativa and Cuscuta approximata

    红色箭头表示在形态上和菟丝子种子相似的紫花苜蓿种子。

    The red arrows indicate alfalfa seeds that are morphologically similar to dodder seeds.

    图 3  寄生在紫花苜蓿上的菟丝子

    Figure 3.  Cuscuta approximata twining around Medicago sativa

     A: 菟丝子和紫花苜蓿建立的寄生系统,红色箭头表示菟丝子吸器;B: 成熟后的菟丝子种子和紫花苜蓿种子混杂在一起。

    A: The parasitic system established between dodder and alfalfa. The red arrow indicates the haustorium of dodder, Scale bar = 5 mm; B: The intermingled mature seeds of dodder and alfalfa.

    图 4  苜蓿菟丝子和紫花苜蓿种质间的电泳结果

    Figure 4.  The electrophoresis results obtained for dodder and alfalfa accessions

    苜蓿菟丝子的1 − 3编号表示3种不同来源的苜蓿菟丝子种子(编号1 − 3,同表1),紫花苜蓿的1 − 8编号表示紫花苜蓿的8个不同种质(编号1 − 8,同表1)。M: 2 000 DNA marker; H2O:负对照。

    Lanes 1 − 3: dodder (Nos. 1 − 3, Table 1), dodder seed from three different habitats; Lanes 1 − 8: alfalfa (Nos. 1 − 8, table 1), eight alfalfa accessions. M: 2 000 DNA marker; H2O: negative control.

    图 5  苜蓿菟丝子种子和紫花苜蓿种子不同比例DNA混合物的电泳结果

    Figure 5.  The electrophoresis results obtained for mixtures of dodder and alfalfa seed DNA

    A:紫花苜蓿种子中混有不同比例苜蓿菟丝子种子的电泳结果;B:苜蓿菟丝子种子和紫花苜蓿种子DNA比例为1 ꞉ 5 000的二次PCR扩增电泳结果;C:苜蓿菟丝子种子和紫花苜蓿种子DNA比例为1 ꞉ 10 000的二次PCR扩增电泳结果。M: 2 000 DNA marker; H2O:负对照。

    A: The electrophoresis results obtained for alfalfa seeds mixed with dodder seeds in different proportions; B: The DNA ratio of dodder and alfalfa seed was 1 ꞉ 5 000 for the second PCR amplification; C: The DNA ratio of dodder and alfalfa seed was 1 ꞉ 10 000 for the second PCR amplification. M: 2 000 DNA marker; H2O: negative control.

    图 6  苜蓿菟丝子和紫花苜蓿不同比例种子粒数混合的电泳结果

    Figure 6.  The electrophoresis results obtained for different numbers of dodder seeds mixed with alfalfa seeds

    紫花苜蓿种子中混有不同粒数苜蓿菟丝子种子的电泳结果。M: 2 000 DNA marker; H2O:负对照。

    The electrophoresis results obtained for alfalfa seeds mixed with different number of dodder seeds. M: 2 000 DNA marker; H2O: negative control.

    图 7  鉴定种子形态相似牧草的总结流程图

    Figure 7.  A summary flowchart for the discrimination of forage seeds with similar morphologies

    右侧为该流程的时间轴,可同时进行PCR和琼脂糖胶的制备,整个实验流程可在大约5 h完成。

    The time required is shown on the right, with polymerase chain reaction (PCR) and agarose gel preparation being performed simultaneously, and the total protocol can be completed in approximately 5 h.

    表 1  紫花苜蓿和苜蓿菟丝子种质资源信息

    Table 1.  Germplasm accessions of Medicago sativa and Cuscuta approximata used in this study

    物种名
    Species
    编号
    No.
    材料
    Material
    来源国家
    Country
    of origin
    苜蓿菟丝子
    Cuscuta approximata
    1 “至仁同济”苜蓿菟丝子 Zhiren Tongji dodder 中国
    China
    2 榆中苜蓿菟丝子
    Yuzhong dodder
    中国
    China
    3 “惠仁堂”苜蓿菟丝子
    “Huirentang” dodder
    中国
    China
    紫花苜蓿
    Medicago sativa
    1 中苜2号
    Zhongmu No.2
    中国
    China
    2 陇东3号
    Longdong No.3
    中国
    China
    3 陇东苜蓿
    Longdong
    中国
    China
    4 瑞西斯
    Resistador
    丹麦
    Denmark
    5 巨人4号
    Ameristand No.4
    美国
    America
    6 阿尔冈金
    Algonguin
    加拿大
    Canada
    7 巨人3号 美国
    America
    8 金皇后
    Golden-queen
    美国
    America
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    表 2  8份紫花苜蓿种质和3份不同产地苜蓿菟丝子的4项种子形态指标

    Table 2.  Statistical analyses of four morphological indices between the seeds of eight Medicago sativa accessions and Cuscuta approximata from different habitats

    指标
    Parameter
    项目
    Item
    苜蓿菟丝子
    Cuscuta
    approximata
    紫花苜蓿
    Medicago
    sativa
    种子长度
    Seed length/mm
    变幅 Range 1.3~1.8 1.7~2.1
    均值 Mean 1.4 ± 0.14 1.2 ± 0.13
    种子宽度
    Seed width/mm
    变幅 Range 1.0~1.4 0.9~1.3
    均值 Mean 1.2 ± 0.13 1.9 ± 0.09
    种子周长
    Seed perimeter/mm
    变幅 Range 3.6~4.8 4.4~5.4
    均值 Mean 4.1 ± 0.34 5.0 ± 0.26
    种子面积
    Seed area/mm2
    变幅 Range 1.0~1.6 1.3~2.0
    均值 Mean 1.3 ± 0.20 1.7 ± 0.17
     n = 30.
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  • 通讯作者:  刘志鹏, lzp@onlabwinterschool.com
  • 收稿日期:  2021-05-23
  • 接受日期:  2021-10-13
  • 网络出版日期:  2022-03-21
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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