引用本文: 李苏涛，李妍，张磊，陈思齐，韩雪林，张娟，苏德伟，罗海凌，周晶. 基于实时荧光定量PCR筛选巨菌草内参基因. 草业科学, 2022, 39(5): 1-15 doi: shu

Citation: LI S T, LI Y, ZHANG L, CHEN S Q, HAN X L, ZHANG J, SU D W, LUO H L, ZHOU J. Screening of reference genes of based on real-time fluorescence quantitative PCR. Pratacultural Science, 2022, 39(5): 1-15 doi: shu

基于实时荧光定量PCR筛选巨菌草内参基因

李苏涛 ¹ ,
李妍 ¹ ,
张磊 ¹ ,
陈思齐 ¹ ,
韩雪林 ¹ ,
张娟 ¹ ,
苏德伟 ² ,
罗海凌 ² ,
周晶 ^{2, ,}

1.
福建农林大学动物科学学院(蜂学学院), 福建福州 350002
2.
福建农林大学国家菌草工程技术研究中心, 福建福州 350002

作者简介: 李苏涛(1997-)，男，江苏南通人，在读硕士生，主要从事动物营养与饲料科学研究。E-mail: 1156034071@qq.com

通讯作者: 周晶(1983-)，女，甘肃兰州人，助理研究员，博士，主要从事草业科学与饲料科学理论研究及技术应用。E-mail: zhoujing_lz@hotmail.com

基金项目: 国家自然科学基金项目(32101418，42075116)；福建省重大专项(2021NZ0101)

摘要: 以巨菌草(Pennisetum giganteum)的叶片、茎、根为试验材料，通过分析8个基因18s rRNA、Actin、GAPDH、ACTB、EF-1α、UBQ、CYP、TUB在正常生长、干旱以及盐碱胁迫下荧光定量PCR中稳定性表达情况，筛选巨菌草的稳定内参基因。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件计算内参基因的表达稳定值并进行排序，最终通过赋值法综合排序确定稳定内参基因。结果表明，内参基因的稳定性在不同处理下存在差异。其中，ACTB稳定性好，为本研究筛选出巨菌草的内参基因。本研究筛选出的内参基因，为后续巨菌草功能基因表达分析奠定了基础。

关键词:

English

Screening of reference genes of Pennisetum giganteum based on real-time fluorescence quantitative PCR

1.
College of Animal Sciences(College of Bee Science), Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China
2.
National Engineering Research Center of Juncao, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China

Corresponding author: ZHOU Jing　E-mail: zhoujing_lz@hotmail.com

Received Date: 2021-11-12
Accepted Date: 2022-03-08
Available Online: 2022-04-21

Abstract: Using the leaves, stems, and roots of giant juncao as experimental materials, eight genes (18s rRNA, Actin, GAPDH, ACTB, EF-1α, UBQ, CYP, TUB) were analyzed using fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR) to select stable reference genes under normal, drought, and salt-alkali growth conditions. We used geNorm, NormFinder, and BestKeeper software to calculate the expression stability of genes and sorted the genes by the comprehensive ranking of the assignment method. The results showed that the stability of the genes differed under different treatments. In contrast, ACTB was stably expressed and used as the reference gene in this experiment. The experimental results will lay a foundation for the study of functional genes in giant juncao.

Key words:

giant juncao /
real-time fluorescent quantitative PCR /
references genes /
expression stability evaluation /
drought stress /
salt-alkali stress /
comprehensive ranking of assignment method

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图 1 内参基因的PCR扩增产物

Figure 1. PCR amplification products of 8 reference genes

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图 2 内参基因溶解曲线图

Figure 2. Melting curves of 8 reference genes

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图 3 正常生长下不同组织中内参基因geNorm分析稳定值

Figure 3. Expression stability value of the reference genes in different tissues under normal growth by geNorm

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图 4 正常生长下不同组织中配对差异分析(V_n/n+1)最佳组合的内参基因数

Figure 4. Paired difference analysis (Vn_/n+1), the best combination of reference genes number in different tissues under normal growth

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图 5 不同干旱胁迫、不同组织中内参基因geNorm分析稳定值

Figure 5. Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different drought stress by geNorm

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图 6 不同干旱胁迫、不同组织中配对差异分析(V_n/n+1)最佳组合的内参基因数

Figure 6. Paired difference analysis (V_n/n+1), the best combination of reference genes number in different tissues under different drought stresstress

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图 7 不同盐碱胁迫、不同组织中内参基因geNorm分析稳定值

Figure 7. Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different salt-alkali stress by geNorm

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图 8 不同盐碱胁迫、不同组织中配对差异分析(V_n/n+1)最佳组合的内参基因数

Figure 8. Paired difference analysis (V_n/n+1), the best combination of reference genes number in different tissues under different salt-alkali stress

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表 1 内参基因信息及其引物序列

Table 1. Information of reference genes and their primer sequences

基因 Gene	上游引物 Forward primer (5′-3′)	下游引物 Reverse primer (5′-3′)	片段大小 Clip size/bp	基因编号 Gene ID
18s rRNA	CTACGTCCCTGCCCTTTGTACA	ACACTTCACCGGACCATTCAA	65	AK059783
GAPDH	CCATCACTGCCACACAGAAAAC	AGGAACACGGAAGGACATACCAG	170	X07156.1
Actin	TGCTCAGTGGAGGGTCTACCAT	CAGGTGGTGCAATCACTTTAAT	108	PgACT
ACTB	CTGGAATGGTCAAGGCTGGT	TCCTTCTGTCCCATCCCTACC	112	XM_008658343.4
EF-1α	TGGGCCTACTGGTCTTACTACTGA	ACATACCCACGCTTCAGATCCT	135	NM_001112117.1
UBQ	CAGCAGCGGCTCATCTT	GCTTCTTGGGCTTGGTGTA	154	AK061988
TUB	GCTGACCACACCTAGCTTTGG	AGGGAACCTTAGGCAGCATGT	82	AK072502
CYP	TGTAGACCACGTCCATTCCA	GCTGGGAAAGATACAAACGGA	115	XM_037608623.1

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表 2 正常生长下不同组织中内参基因NormFinder分析稳定值

Table 2. Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under normal growth by NormFinder

组织 Tissue	内参基因Reference gene
组织 Tissue	18s rRNA	GAPDH	Actin	ACTB	EF-1α	UBQ	CYP	TUB
叶 Leaf	0.052	0.213	0.017	0.017	0.030	0.185	0.322	0.056
茎 Stem	0.126	0.111	0.095	0.006	0.419	0.039	0.036	0.126
根 Root	0.021	0.053	0.034	0.010	0.114	0.087	0.429	0.121

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表 3 正常生长下不同组织中内参基因BestKeeper分析标准差

Table 3. Standard deviation of reference genes in different tissues under normal growth by BestKeeper analysis

组织 Tissue	内参基因 Reference gene
组织 Tissue	18s rRNA	GAPDH	Actin	ACTB	EF-1α	UBQ	CYP	TUB
叶 Leaf	0.10	0.21	0.04	0.07	0.04	0.15	0.34	0.05
茎 Stem	0.09	0.09	0.08	0.04	0.42	0.05	0.05	0.16
根 Root	0.04	0.10	0.04	0.08	0.14	0.09	0.40	0.14

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表 4 不同干旱胁迫、不同组织中内参基因NormFinder分析稳定值

Table 4. Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different drought stress by NormFinder

干旱胁迫时间 Drought stress time/d	组织 Tissue	内参基因 Reference genes
干旱胁迫时间 Drought stress time/d	组织 Tissue	18s rRNA	GAPDH	Actin	ACTB	EF-1α	UBQ	CYP	TUB
7	叶 Leaf	0.068	0.097	0.100	0.006	0.060	0.051	0.236	0.016
	茎 Stem	0.021	0.015	0.062	0.020	0.036	0.347	0.034	0.273
	根 Root	0.029	0.133	0.086	0.029	0.129	0.143	0.149	0.273
14	叶 Leaf	0.077	0.015	0.015	0.020	0.083	0.324	0.254	0.094
	茎 Stem	0.024	0.039	0.086	0.113	0.086	0.031	0.201	0.107
	根 Root	0.052	0.089	0.042	0.044	0.050	0.016	0.041	0.101
21	叶 Leaf	0.106	0.009	0.012	0.032	0.083	0.039	0.217	0.155
	茎 Stem	0.046	0.067	0.080	0.009	0.185	0.118	0.195	0.035
	根 Root	0.018	0.018	0.062	0.075	0.158	0.191	0.129	0.183

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表 5 不同干旱胁迫、不同组织中内参基因BestKeeper分析稳定值

Table 5. Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different drought stress by BestKeeper

干旱胁迫时间 Drought stress time/d	组织 Tissue	内参基因的标准差 The standard deviation of reference genes
干旱胁迫时间 Drought stress time/d	组织 Tissue	18s rRNA	GAPDH	Actin	ACTB	EF-1α	UBQ	CYP	TUB
7	叶 Leaf	0.07	0.11	0.11	0.08	0.06	0.07	0.24	0.03
	茎 Stem	0.07	0.05	0.10	0.02	0.09	0.31	0.09	0.24
	根 Root	0.06	0.13	0.03	0.07	0.12	0.13	0.16	0.30
14	叶 Leaf	0.09	0.04	0.05	0.04	0.09	0.33	0.24	0.10
	茎 Stem	0.02	0.08	0.12	0.09	0.06	0.05	0.22	0.07
	根 Root	0.03	0.11	0.08	0.01	0.10	0.06	0.02	0.11
21	叶 Leaf	0.13	0.07	0.05	0.02	0.11	0.02	0.19	0.17
	茎 Stem	0.07	0.06	0.08	0.06	0.16	0.10	0.21	0.06
	根 Root	0.02	0.03	0.10	0.10	0.16	0.21	0.10	0.16

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表 6 不同盐碱胁迫、不同组织中内参基因NormFinder分析稳定值

Table 6. Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different salt-alkali stress by NormFinder

盐碱胁迫浓度 Salt-alkali stress concentration/(mmol·L⁻¹)	组织 Tissue	内参基因 Reference genes
盐碱胁迫浓度 Salt-alkali stress concentration/(mmol·L⁻¹)	组织 Tissue	18s rRNA	GAPDH	Actin	ACTB	EF-1α	UBQ	CYP	TUB
60	叶 Leaf	0.157	0.115	0.136	0.101	0.027	0.062	0.146	0.090
	茎 Stem	0.089	0.063	0.041	0.069	0.076	0.090	0.146	0.034
	根 Root	0.074	0.029	0.154	0.121	0.189	0.130	0.039	0.086
120	叶 Leaf	0.012	0.011	0.011	0.040	0.153	0.151	0.335	0.104
	茎 Stem	0.072	0.110	0.134	0.099	0.089	0.027	0.266	0.086
	根 Root	0.175	0.032	0.115	0.130	0.139	0.064	0.116	0.162
180	叶 Leaf	0.039	0.013	0.134	0.156	0.107	0.097	0.097	0.098
	茎 Stem	0.092	0.051	0.174	0.023	0.083	0.14	0.235	0.013
	根 Root	0.077	0.150	0.113	0.054	0.020	0.017	0.196	0.137

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表 7 不同盐碱胁迫、不同组织中内参基因BestKeeper分析标准差

Table 7. Standard deviation of reference genes in different tissues under different salt-alkali stress by BestKeeper analysis

盐碱胁迫浓度 Salt-alkali stress concentration/(mmol·L⁻¹)	组织 Tissue	内参基因 Reference genes
盐碱胁迫浓度 Salt-alkali stress concentration/(mmol·L⁻¹)	组织 Tissue	18s rRNA	GAPDH	Actin	ACTB	EF-1α	UBQ	CYP	TUB
60	叶 Leaf	0.16	0.10	0.13	0.13	0.03	0.09	0.15	0.07
	茎 Stem	0.08	0.04	0.05	0.09	0.04	0.12	0.18	0.04
	根 Root	0.03	0.11	0.22	0.08	0.25	0.16	0.16	0.10
120	叶 Leaf	0.07	0.04	0.05	0.12	0.22	0.21	0.25	0.18
	茎 Stem	0.10	0.14	0.13	0.10	0.07	0.04	0.24	0.10
	根 Root	0.15	0.04	0.13	0.11	0.13	0.08	0.13	0.18
180	叶 Leaf	0.08	0.04	0.18	0.17	0.12	0.09	0.07	0.06
	茎 Stem	0.09	0.09	0.18	0.07	0.12	0.17	0.17	0.06
	根 Root	0.15	0.13	0.15	0.09	0.11	0.07	0.25	0.04

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表 8 不同处理、不同组织中内参基因稳定性综合排序

Table 8. Comprehensive ranking of the stability of reference genes in different tissues under different treatments

处理组 Treatment group	内参基因 Reference gene	叶 Leaf		茎 Stem		根 Root
处理组 Treatment group	内参基因 Reference gene	稳定性分值 Stability score	排序 Ranking	稳定性分值 Stability score	排序 Ranking	稳定性分值 Stability score	排序 Ranking
正常生长 Normal growth	18s rRNA	14	Ⅴ	16	Ⅴ	8	Ⅱ
	GAPDH	21	Ⅶ	16	Ⅴ	10	Ⅲ
	Actin	3	Ⅰ	11	Ⅳ	11	Ⅳ
	ACTB	6	Ⅱ	3	Ⅰ	5	Ⅰ
	EF-1α	8	Ⅲ	24	Ⅷ	16	Ⅵ
	UBQ	18	Ⅵ	6	Ⅱ	15	Ⅴ
	CYP	24	Ⅷ	8	Ⅲ	24	Ⅷ
	TUB	11	Ⅳ	20	Ⅶ	16	Ⅵ
干旱胁迫 Drought stress	18s rRNA	14	Ⅳ	3	Ⅰ	3	Ⅰ
	GAPDH	5	Ⅰ	7	Ⅲ	11	Ⅳ
	Actin	6	Ⅱ	18	Ⅶ	9	Ⅲ
	ACTB	7	Ⅲ	6	Ⅱ	7	Ⅱ
	EF-1α	14	Ⅳ	17	Ⅵ	19	Ⅶ
	UBQ	14	Ⅳ	16	Ⅴ	18	Ⅵ
	CYP	22	Ⅷ	24	Ⅷ	15	Ⅴ
	TUB	21	Ⅶ	11	Ⅳ	24	Ⅷ
盐碱胁迫 Salt-alkali stress	18s rRNA	14	Ⅴ	13	Ⅴ	17	Ⅵ
	GAPDH	3	Ⅰ	8	Ⅱ	8	Ⅲ
	Actin	14	Ⅴ	19	Ⅶ	20	Ⅷ
	ACTB	21	Ⅶ	8	Ⅱ	7	Ⅱ
	EF-1α	13	Ⅳ	9	Ⅳ	17	Ⅵ
	UBQ	7	Ⅱ	18	Ⅵ	4	Ⅰ
	CYP	24	Ⅷ	24	Ⅷ	15	Ⅴ
	TUB	8	Ⅲ	3	Ⅰ	14	Ⅳ

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图(8)表(8)

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142

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基于实时荧光定量PCR筛选巨菌草内参基因

作者简介: 李苏涛(1997-)，男，江苏南通人，在读硕士生，主要从事动物营养与饲料科学研究。E-mail: 1156034071@qq.com

通讯作者: 周晶(1983-)，女，甘肃兰州人，助理研究员，博士，主要从事草业科学与饲料科学理论研究及技术应用。E-mail: zhoujing_lz@hotmail.com

English

Screening of reference genes of Pennisetum giganteum based on real-time fluorescence quantitative PCR

Corresponding author: ZHOU Jing E-mail: zhoujing_lz@hotmail.com

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Corresponding author: ZHOU Jing　E-mail: zhoujing_lz@hotmail.com